2.1 去细胞基质支架  细胞支架能够为种子细胞的黏附、生长、增殖、分化及基质分泌提供三维结构及合适的微环境，是组织工程椎间盘的基础。理想的髓核支架应该具备以下几点[4]：具有良好的生物相容性，能与周围椎间盘组织良好融合；具有三维结构，表面及内层较粗糙，适合种子细胞的黏附、生长、增殖、分化及蛋白分泌；具有一定的形状，形状可根据需要塑形，并需要一定的生物力学强度及伸缩性；具有较高的孔隙率及合适的孔径大小[5]，孔径一般在100-300 µm之间较为合适，有利于种子细胞的黏附、生长、增殖、分化及基质分泌；具有良好的降解性，在新的组织形成过程中逐渐降解；来源广泛，取材简便。     组织工程支架材料来源广泛，去细胞基质是其中一种新近出现的理想材料。细胞外基质主要是由细胞分泌到细胞外间充质中的蛋白质和多糖类大分子物质构成，去细胞基质结构极其类似于正常组织或器官，通过复杂的网架连接结构，构成高度复杂的类似于正常组织细胞外的微环境，对种子细胞的生存、诱导、分化、表型维持等生理活动具有关键的调节作用，同时去细胞基质去除了组织原有细胞，消除了抗原性，具有良好的生物相容性。天然细胞外基质具有复杂的结构，很难在体外重构与体内细胞外基质组成相同和结构一致的材料，研究者们经过不断试验，目前主要通过化学物理或酶学去细胞方法从细胞组织和器官获得天然的细胞外基质，为解决这一难题提供了新的有效解决途径。去细胞化基质材料已被广泛应用于组织工程和再生医学领域，包括诱导干细胞的定向分化及形成各种功能性组织器官等。因为椎间盘结构的特殊性，去细胞化基质材料应用于椎间盘再生、修复的研究起步较晚，但目前正逐渐成为研究热点，根据去细胞基质构建椎间盘组织支架的种类不同可分为去细胞基质纤维环支架、去细胞基质髓核支架及去细胞基质一体化椎间盘支架。 2.1.1  纤维环支架 纤维环主要成分为Ⅰ型胶原，其中外层纤维环主要为Ⅰ型胶原，但靠近髓核的内参纤维环主要为Ⅱ型胶原，由定向排列的15-25层胶原纤维层面按同心圆的方式排列组成[6]，同一层的胶原纤维互相平行，且任一相邻层面的胶原纤维排列方向都是相反的，胶原纤维层面之间分布着排列方向与片层胶原纤维方向一致的弹力蛋白，一部分弹力蛋白穿过片层起着桥接作用[7]。纤维环的这种组成结构有利于纤维环承受更大的负荷，维持纤维环片层间的稳固，组织结构致密，因此具有限定髓核的作用。单纯的组织工程髓核存在移植困难问题，但联合组织工程纤维环进行完整椎间盘移植则是可行的，因此组织工程纤维环支架具有重要研究价值。目前组织工程纤维环支架研究较多较深入，大多为非去细胞基质类材料，如聚乳酸-聚己内酯[8]、纳米羟基磷灰石[9]、蚕丝[10]、丝素蛋白等[11]，但这些材料成分单一，在成分上均与正常纤维环相去甚远，且在生物力学性能、生物相容性、材料降解性能等方面均存在一些缺陷，同时材料内部微环境无法模拟正常纤维环微环境，对种子细胞的黏附、生存、诱导、分化、表型维持等方面均有不利影响。近年来，有不少研究者采用去细胞基质构建纤维环支架，他们成功将组织脱细胞后构建纤维环支架。虽然目前采用去细胞基质构建纤维环支架的报道不多，但相关研究逐渐增多，正成为组织工程纤维环支架材料研究的热点。根据目前去细胞基质构建纤维环支架的组织材料来源不同可分为脱矿脱细胞骨基质环及脱细胞纤维环支架。  脱矿脱细胞骨基质环：股骨跟胫骨具有坚韧的骨皮质及疏松多孔的骨松质，经脱钙、脱细胞处理后质地较韧，具有的环形形状与纤维环形状一致，脱钙、脱细胞处理后组织富有弹性，主要成分为Ⅰ型胶原，这些均类似于纤维环组织，同时具有理想孔隙率及孔径。潘勇[12]采用中性去污剂-核酸酶4步方法脱细胞，采用盐酸处理脱钙、塑形、冷冻干燥后制得脱矿脱细胞骨基质环，经接种纤维环细胞后分别培养1，2，3个月，相关细胞外基质蛋白逐渐增加，并最终填充支架孔隙，形成形态、功能类似于正常纤维环的组织，该研究表明此种支架能够维持纤维环细胞的表型特点，合成与纤维环组织相一致的细胞外基质，还具有一定的柔韧性，可适应适当扭曲，因此脱矿脱细胞股骨髁骨基质环可作为一种较理想的纤维环支架材料。但脱矿脱细胞骨基质环但存在以下缺陷：体外培养的复合物原有成分降解不明显，降解速度不易控制，可能会导致抗原性消除不确定等问题；3个月后的复合物成分与正常纤维环仍有差距，不能很好地模拟纤维环牢固的生物力学性能，使其应用受到限制。总之，脱矿脱细胞骨基质环可作为一种较理想的纤维环。 脱细胞纤维环支架：脱细胞纤维环基本保留了正常纤维环的三维结构，去除了原有纤维环细胞及小分子抗原物质，具备良好的生物相容性，具备类似于正常纤维环的外形，较好的生物力学强度及良好的柔韧性，支架内部微环境极其接近正常纤维环，因此很好地促进了种子细胞的黏附、生存、诱导、分化、表型维持及细胞外基质的分泌。 由于拥有以上诸多优点，目前脱细胞纤维环基质是采用诸多去细胞基质构建纤维环支架研究中选用最多的材料。董兴成[13]利用中性去污剂-核酸酶4步方法脱细胞，经冻干、消毒制得脱细胞兔纤维环支架，经生物力学测试后，接种骨髓间充质干细胞和纤维环细混悬液，体外培养并检测细胞外基质分泌情况，他们采用保留两侧终板，吸空髓核后脱细胞处理并植入体内椎间隙观察生物相容性，8周后取出行苏木精-伊红染色，支架内部未发现明显炎症反应，支架周围可见炎症细胞浸润。文中制备的去细胞纤维环支架孔隙率为(42.86±3.41)%，未提及孔径大小。上述脱细胞纤维环支架是采用脱细胞处理后的纤维环基质，去除了细胞及小分子抗原成分，基质蛋白损失小，基本保留了原有纤维环三维结构及微环境，但存在孔隙率较低的不足，并且未测量孔径大小，而孔隙率及孔径大小是组织工程支架非常重要的指标之一，因此限制了采用以上脱细胞方法处理后纤维环基质在组织工程纤维环构建中的应用。唐雪彬[14]取猪纤维环组织剪碎，液氮反复冷冻研磨成粉状，通过胰酶、核酸酶、Triton X-100脱细胞处理的方法制得脱细胞猪纤维环材料，通过接种骨髓间充质干细胞，检测到该材料可以增强种子细胞的增殖能力及分化潜能。 2.1.2  髓核支架 椎间盘退变的关键在于髓核的退    变[15]，即髓核细胞数量减少及功能老化，致髓核细胞外基质分泌减少，进而含水能力减弱，弹性降低，随时间的延长，可能导致椎间盘突出压迫脊神经跟及脊髓等严重后 果[16]。传统方法对髓核的退变无有效治疗措施，无法阻止甚至逆转髓核的退变，而髓核组织工程应运而生，为修复、再生退变髓核带来了新的治疗思路。构建组织工程髓核的研究很多，大多采用可注射型材料来源构建髓核支架，例如：藻酸盐[17]、壳聚糖[18]、二型胶原[19-20]、透明质酸等[21]，易于移植体内是该类支架的最大优势，但是该类支架大都存在生物力学强度差、孔隙率低及孔径小的缺陷，其中力学强度低导致移植早期无法承受正常髓核的压力而致失败，孔隙率低及孔径小导致种子细胞无法向支架内部迁移，这些缺陷限制其进一步的应用推广。去细胞基质生物力学强度、三维结构及支架局部微环境均接近正常髓核，同时Mercuri等[22]证实种子细胞可成功向去细胞髓核内部迁移，以上特点让去细胞基质拥有其他材料无可比拟的优势，髓核脱细胞技术的完善，解决了去细胞基质应用于髓核组织工程的关键瓶颈，目前采用去细胞基质构建髓核支架正成为组织工程髓核的研究热点，同样根据目前构建髓核支架的去细胞基质材料的来源不同可分为脱细胞软骨基质来源的多孔支架、脱细胞髓核细胞来源基质及脱细胞髓核基质。     脱细胞软骨基质来源的多孔支架：软骨脱细胞基质构建组织工程软骨研究较早，技术相对成熟[23-24]，杨强等[25]已成功在体外及裸鼠体内构建组织工程软骨。髓核基质跟关节软骨基质在许多方面相似，比如细胞外基质成分极其相似，都富含Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖及其他一些蛋白成分，只是在各蛋白成分比例上有所差异，因此利用脱细胞软骨基质做为材料来源制备髓核支架具有较好的生物相容性及微环境，况且杨强等制备的多孔支架具有孔隙率高、孔径大小合适的特点，因此软骨脱细胞基质可作为髓核支架一种较理想的材料来源。伍耀宏等[26]将猪软骨经粉碎、离心制备软骨微丝，经脱细胞液脱细胞制备乳糜状悬液，再经冷冻干燥后得到三维多孔支架，经体外接种髓核细胞及皮下种植，6周后组织学评估显示种子细胞保持增殖、分泌活性，产生髓核基质成分，说明该支架复合种子细胞能形成髓核样组织。因为软骨与髓核组织毕竟属两种不同组织来源，虽较人工材料及单一成分材料具有免疫原性低及生物相容性高等优势，但随着髓核脱细胞技术的成熟，研究者更倾向后面的脱细胞髓核支架，因此脱细胞软骨基质来源的多孔支架的应用受到限制，相关研究也不多。总的来说，利用脱细胞软骨基质构建髓核支架是一种较理想的支架。     脱细胞髓核细胞来源基质：髓核细胞在体外经团块培养可分泌大量细胞外基质，再经脱细胞后获得具有类似于髓核组织的三维结构及微环境，具有可在体外大量制备、来源广泛的优点。Yuan等[27]利用胶原包裹髓核细胞形成髓核细胞微球进行体外培养，髓核细胞在胶原微球微环境中分泌大量髓核细胞外基质，形成类似髓核样组织，进一步采用去污剂法将该组织脱细胞获得脱细胞髓核细胞来源基质并用做为支架，通过分别接种人骨髓间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞至该支架上，将接种人骨髓间充质干细胞的复合体在体外培养，分别于不同培养时间点获取样本行苏木精-伊红染色、免疫组化、阿利新蓝染色等组织学检测，通过组织学结果评价种子细胞增殖、分泌细胞外基质情况；将接种大鼠骨髓间充质干细胞的复合体注射植入兔退变椎间盘中，于注射前及注射后1，2，3，6个月分别行影像学观察，结果显示人骨髓间充质干细胞-去细胞髓核来源基质复合体能较好地维持椎间盘高度及含水能力，优于大鼠骨髓间充质干细胞-胶原复合体。该支架的制备具有明显创新性，体外采用髓核细胞团成功制备髓核，同时可采用注射方式移植，既获取了类似正常髓核组织的脱细胞髓核细胞来源基质，又解决了组织工程髓核移植困难的问题，是髓核组织工程去细胞基质支架的良好材料来源，具有广阔的应用前景。 脱细胞髓核基质：脱细胞髓核基质是近2年去细胞基质构建髓核的新的研究方向，采用天然髓核脱细胞后残留的髓核基质做为髓核支架，具有良好的三维结构，基本保留了原有髓核微环境，同时有一定的孔隙率及孔径。 Mercuri等[22，28]采用去污剂-核酸酶法对猪髓核进行脱细胞，并探索最佳脱细胞的浓度、时间以获取最佳脱细胞方案，结果表明采用他们的方法脱细胞彻底，髓核基质蛋白保留较好，是一种理想的脱细胞方法；接种脂肪干细胞后活死细胞染色显示细胞很好地黏附、生存，表明生物相容性好，同时证实有种子细胞可向支架内部迁移，说明采用去污剂-核酸酶法制备的脱细胞基质具有一定的孔隙率及孔径大小，作者认为脱细胞过程中超声处理可能会增加孔隙率。张朋等[29]采用兔髓核为实验对象，探讨了去污剂-核酸酶脱细胞法的最佳振荡频率及去污剂浓度，通过设置不同振荡频率(0，80，130，180 r/min)及不同去污剂浓度(1%，3%，5%)，比较各组的形态学及苏木精-伊红染色结果，选出最佳振荡频率及去污剂浓度，初步优化了髓核组织的去细胞方法。曹纬等[30]取材兔髓核，同样采用优化去污剂-核酸酶脱细胞步骤脱细胞，对去细胞髓核支架进行了组织学、生物力学、电镜、生物学相容性、细胞毒性等相关研究，较全面评估了去细胞髓核支架的性能，证明采用去污剂-核酸酶法脱细胞彻底且细胞外基质成分损失较少，脱细胞髓核基质具有较好的生物力学特性，无细胞毒性。张超等[31]分别用化学萃取法跟酶消法处理1岁龄与1月龄beagle犬髓核制备去细胞髓核支架，结果表明采用酶消法处理的1岁龄犬髓核能更好地保留细胞外基质，毒性更低，是制备去细胞髓核支架的良好方法。 髓核基质支架的制备尽管已有以上较多报道，但均缺乏支架孔径大小及孔隙率的精确测量研究，缺乏种子细胞接种入髓核去细胞支架后的体外长期培养及动物体内实验，该支架的实用性有待进一步的研究。 2.1.3 一体化椎间盘支架 椎间盘由髓核及纤维环共同组成，两者密切联系，缺一不可，构建组织工程椎间盘最理想的支架就是包含髓核及纤维环在内的一体化支架，具有接近正常椎间盘性能、易于手术植入置换的显著有点。许海委等[32]分别采用脱细胞脱钙骨基质跟脱细胞髓核基质作为纤维环支架跟髓核支架，其中脱细胞脱钙骨基质方法与上述一致，脱细胞髓核基质支架的制备方法类似于脱细胞软骨基质支架的方法[23]，采用去污剂-酶4步法对猪髓核脱细胞后，粉碎、梯度离心，收集髓核基质微丝，溶解成3%浓度后冷冻干燥成形，辐照消毒。实验者对该一体化支架并进行理化检测，结果显示其孔隙率较高，孔径合适，基本符合组织工程椎间盘支架的要求，是一种组织工程椎间盘的理想支架。闫中胜[33]同样以脱矿脱细胞骨基质作为纤维环支架，但髓核支架采用的是天然材料Ⅱ型胶 原/透明质酸混合物构建，并将两者复合构建为一体化椎间盘支架，接种骨髓间充质干细胞体外构建出类椎间盘组织，进行相关理化指标检测及生物力学试验，各项指标均与正常髓核存在较大差距，因此在一定程度上限制了该一体化椎间盘支架的应用推广。     一体化支架研究尚处于初级阶段，目前采用脱细胞脱钙骨基质复合脱细胞髓核基质构建的一体化椎间盘支架，尚无复合接种种子细胞构建组织工程椎间盘的体内外相关报道。去细胞基质构建的一体化支架既拥有去细胞基质的优良特性，又能以完整椎间盘的形式进行体内移植，相信凭借这些以上优势其应用具有广阔的前景。 2.2  存在的不足、解决措施 去细胞基质做为组织工程椎间盘支架来源，目前已成为组织工程支架研究的热点，相对各种人工材料及单一天然蛋白成分来源的支架，它具有自己显著的优点，抗原性小，生物相容性高，最为接近正常髓核三维结构及细胞生长所需的微环境。但去细胞基质做为组织工程椎间盘支架同时仍存在少量不足，亟待进一步改进。首先，采用四步脱细胞方法制备的去细胞髓核基质大都孔隙率较低、孔径较小。合适的孔径是细胞迁移、进一步形成正常髓核团簇状分布的前提，优化四步脱细胞方法，通过增加振荡频率与增加超声处理时间可能会进一步改善其孔隙率及孔径大小；采用脱细胞后粉碎、冷冻干燥制备的去细胞髓核基质孔隙率及孔径均较理想，但破坏了原有三维结构。既保留原有三维结构，有合适的孔隙率及孔径，又去除细胞彻底的去细胞基质支架可能是以后研究的目标。其次，目前去细胞基质构建的一部分髓核支架及一体化椎间盘支架暂停留在支架的制备及性能检测，未接种种子细胞在体外及体内构建出椎间盘，亟待后面的研究者进一步研究，证实其可行性。第三，椎间盘细胞缺乏特异性的抗原标记，目前采用间充质干细胞接种至去细胞基质并诱导分化为椎间盘细胞的诸多方法，均无法直接有效证明诱导椎间盘细胞成功，只能证明为类椎间盘细  胞[34]。可通过多种方法检测椎间盘细胞的相关基质蛋白分泌量，以及表达的特异性RNA定量或半定量测定，提高干细胞被接种至去细胞基质支架后能成功分化为椎间盘细胞的可信度。第四，去细胞基质基本接近正常椎间盘的三维结构及微环境，那么去细胞基质本身会不会对种子细胞向椎间盘细胞分化具有诱导作用，以及对椎间盘细胞表型具有维持作用？如果确实存在，那么去细胞基质作为椎间盘支架具有得天独厚的优势，但需要后续的研究者们进一步研究证实。最后，体外培养支架-细胞复合物与正常人体椎间盘微环境存在差别，如体内椎间盘低氧环境对髓核细胞的表型维持有重要作用[35]，体内椎间盘无血液供应，营养状态较差，而体外培养的细胞营养较丰富，无法完全模拟椎间盘细胞生长环境，限制了实验结果的使用价值。可采用厌氧培养箱及低血清浓度等方法尽量模拟人体椎间盘低氧低营养的微环境[36]，减少实验误差，提高实验数据价值。"